Mẫu cấy bị hóa nâu: nguyên nhân và cách khắc phục
Sau vài ngày cấy, vết cắt và vùng thạch quanh mẫu chuyển nâu rồi đen, mẫu ngừng phát triển và có thể chết. Đây là hiện tượng hóa nâu, rất thường gặp khi đưa mẫu mới vào nuôi cấy.
Vì sao mẫu bị hóa nâu?
Khi mô bị cắt, tế bào ở vết thương giải phóng các hợp chất phenol. Dưới tác dụng của enzyme oxy hóa (như polyphenol oxidase), phenol chuyển thành quinon có màu nâu. Các chất này khuếch tán vào môi trường và gây độc, ức chế sự phát triển của chính mẫu cấy.
Hiện tượng thường nặng hơn ở cây thân gỗ, mô già, mẫu lấy từ cây ngoài vườn và một số loài vốn giàu phenol như chuối.
Các cách hạn chế hóa nâu
1. Chọn và xử lý mẫu cẩn thận
- Ưu tiên mô non, đang sinh trưởng mạnh như chồi đỉnh, chồi bên.
- Dùng dao sắc, cắt dứt khoát để giảm tổn thương; cắt bỏ phần mô đã nâu trước khi cấy.
- Không ngâm mẫu trong dung dịch khử trùng lâu hơn mức cần thiết.
2. Dùng chất chống oxy hóa
Acid ascorbic (vitamin C) và acid citric được dùng để ngâm mẫu sau khi cắt hoặc bổ sung vào môi trường. Mức tham khảo cho vitamin C trong môi trường là 50–100 mg/L; nồng độ cụ thể nên theo quy trình của phòng lab. Xem thêm hướng dẫn dùng vitamin C trong nuôi cấy mô.
3. Dùng chất hấp phụ phenol
- Than hoạt tính (tham khảo 1–2 g/L) hấp phụ phenol và các chất ức chế. Lưu ý than cũng hấp phụ một phần chất điều hòa sinh trưởng và vitamin, nên hiệu quả của các chất này có thể giảm. Xem cách dùng than hoạt tính.
- PVP 40 liên kết với phenol, được dùng trong dung dịch ngâm mẫu hoặc môi trường theo công thức.
4. Điều chỉnh điều kiện nuôi
- Đặt mẫu trong tối vài ngày đầu, vì ánh sáng thúc đẩy quá trình tạo và oxy hóa phenol.
- Cấy chuyển sớm sang môi trường mới khi thấy vùng nâu quanh mẫu, trước khi chất độc tích tụ nhiều.
- Đặt mẫu ở vị trí mới trên mặt thạch khi cấy chuyển, tránh vùng thạch đã nhiễm màu.
Hóa nâu hay nhiễm nấm khuẩn? Phân biệt nhanh
| Hiện tượng | Dấu hiệu nhận biết |
|---|---|
| Hóa nâu | Vùng nâu đến đen nằm sát mẫu, lan dần vào thạch; không thấy sợi nấm hay khuẩn lạc. |
| Nhiễm nấm | Sợi tơ như bông (trắng, xanh, đen…) mọc trên mẫu hoặc mặt thạch, lan rộng nhanh. |
| Nhiễm khuẩn | Vệt nhầy hoặc khuẩn lạc trắng đục, vàng quanh mẫu; môi trường lỏng thì vẩn đục. |
Hóa chất nhắc đến trong bài
Xem theo nhóm: Vitamin cho môi trường nuôi cấy mô · Agar, gelrite, than hoạt tính và phụ gia nuôi cấy mô · Môi trường MS pha sẵn và nguồn carbon
Câu hỏi thường gặp
Hóa nâu có phải do nhiễm nấm khuẩn không?
Không. Hóa nâu do phenol của chính mẫu bị oxy hóa; vùng nâu thường nằm sát mẫu và lan vào thạch. Nhiễm nấm khuẩn thường thấy sợi nấm, khuẩn lạc hoặc môi trường vẩn đục.
Có nên cho than hoạt tính vào mọi môi trường để chống hóa nâu?
Không nên mặc định. Than hoạt tính hấp phụ cả chất điều hòa sinh trưởng và vitamin, nên thường dùng có chọn lọc, ví dụ giai đoạn ra rễ hoặc với loài hóa nâu nặng.
Mẫu đã nâu một phần có cứu được không?
Có thể. Cắt bỏ phần nâu, cấy chuyển phần mô còn xanh sang môi trường mới và đặt vào tối vài ngày.
Loại cây nào dễ bị hóa nâu?
Cây thân gỗ, mô già, mẫu lấy từ cây ngoài vườn và các loài giàu phenol như chuối thường bị hóa nâu nặng hơn.
Nên dùng vitamin C hay than hoạt tính để chống hóa nâu?
Hai chất tác động khác nhau: vitamin C chống oxy hóa phenol, còn than hoạt tính hấp phụ phenol và chất ức chế đã sinh ra. Vitamin C (tham khảo 50–100 mg/L) thường dùng khi vào mẫu; than hoạt tính (tham khảo 1–2 g/L) hấp phụ cả chất điều hòa sinh trưởng nên hay dùng ở giai đoạn ra rễ hoặc với loài hóa nâu nặng.
Tài liệu tham khảo
- George E.F., Hall M.A., De Klerk G.-J. (chủ biên) (2008). Plant Propagation by Tissue Culture, 3rd ed., Vol. 1: The Background. Springer, Dordrecht. doi:10.1007/978-1-4020-5005-3
Về tác giả
Chịu trách nhiệm chuyên môn: CEO Nguyễn Huỳnh Điệp Phương, Cử nhân Hóa học, 15 năm kinh nghiệm làm việc với hóa chất.
Bài viết liên quan
Theo cây trồngNuôi cấy mô lan: danh sách hóa chất cần chuẩn bị
Nuôi cấy mô lan (hồ điệp, Dendrobium…): danh sách hóa chất cho từng giai đoạn khử trùng mẫu, gieo hạt, nhân protocorm, ra rễ và lưu ý chọn công thức.
Xử lý sự cốCây bị thủy tinh thể trong nuôi cấy mô: nguyên nhân và cách khắc phục
Thủy tinh thể trong nuôi cấy mô (hyperhydricity): chồi mọng nước, trong, giòn, khó ra rễ. Nguyên nhân và 5 cách khắc phục trong phòng nuôi cấy mô.
Hỏi đápHấp khử trùng môi trường nuôi cấy ở 121 °C trong bao lâu là đủ?
Hấp khử trùng môi trường nuôi cấy ở 121 °C bao lâu là đủ: thời gian theo thể tích bình, hấp quá lâu gây hại gì và cách kiểm tra nồi hấp đạt hiệu quả.